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史劲松教授课题组在ACS Catalysis发表“设计ASSMD策略并应用于祖先序列挖掘与工程化”的研究工作

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发布时间:2024-11-05  来源:生命科学与健康工程学院   文/图:汪子凯;审核:史志洪  点击数:

在国家自然科学基金和国家重点研发计划等项目的资助下,江南大学生命科学与健康工程学院史劲松教授课题组在极端嗜热祖先腈水解酶的挖掘与机制解析方面的研究工作取得重要进展。研究成果以“Designing ASSMD Strategy for Exploring and Engineering Extreme Thermophilic Ancestral Nitrilase for Nitriles Biocatalysis”为题于2024年9月发表在ACS Catalysis杂志上。江南大学2021级博士研究生汪子凯为第一作者,生命科学与健康工程学院龚劲松教授和生物工程学院陆震鸣教授为通讯作者。

酶的热稳定性对于延长反应时间和可重复使用性至关重要。极端酶以其高热稳定性而闻名,在生物催化领域被广泛关注。极端酶在极端条件下进化,可能在适应当前环境的进化过程中已经灭绝。幸运的是,祖先酶序列重构可以通过计算机算法推演出现有酶的祖先酶序列。该研究旨在开发ASSMD工作流,探究腈水解酶进化景观,挖掘极端嗜热祖先腈水解酶并解析祖先酶热稳定性与催化特性机制。

(1)本研究为了揭示进化景观的分子水平信息,设计了一个构建祖先酶序列-结构-动力学参数库的工作流,称为ASSMD策略。

(2)该策略被用于挖掘极端嗜热祖先腈水解酶的研究中。腈水解酶可以催化腈类化合物水解成羧酸,被广泛应用于制药、食品和化工等各个领域。首先,使用系统发育树展开腈水解酶的进化历史,以创建祖先酶序列库,其中包括69个代表树根和分支的祖先酶序列。研究发现,基于ASSMD策略,腈水解酶进化景观中存在一个动力学柔性洼地(该区域的祖先腈水解酶的RMSD值明显低于其他区域),包括七种祖先酶。

(3)进一步对这些祖先酶进行实验表征,发现了一种极端嗜热的祖先酶ASR135,能够耐受高达90℃的高温。基于半衰期、变性温度以及最适反应温度推测,ASR135可能来源于已经灭绝的极端物种。

(4)为了更深入地了解其进化信息,通过结合能量计算和实验室进化,对其进化事件进行了进一步分析。基于实验室人工进化进一步增强了ASR135的热稳定性,获得了一种突变体ASR135-M4,即使在沸水温度(100℃)下也能表现出水解活性。

(5)进一步研究表明,ASR135-M4在经过实验室进化以提高其热稳定性后,在其结构中表现出额外的盐桥、氢键、π-烷基相互作用四面体笼和增强的疏水核心,表现出鲁棒性强的相互作用网络。

(6)为充分挖掘本研究中所探究的祖先酶的应用潜力,探究了祖先腈水解酶的底物谱,发现该祖先酶具有明显的芳香腈类的底物偏好性。最后对这种腈水解酶的芳香腈底物偏好性进行了机制解析,成功发现了一种活性中心CYS与底物的“指向/背向”机制。这种机制展示了芳香/脂肪腈被亲核进攻的概率差异,从而导致腈水解酶对两种底物的底物偏好性差异。总的来说,该研究证明了ASSMD策略在发现更多具有极端嗜热性的祖先腈水解酶资源以获得各种工业应用的耐热酶方面的潜力。

该研究成功通过祖先序列挖掘优化获得了一个全新的极端腈水解酶,其在沸水条件下的催化活性为腈水解酶在极端条件的生物催化应用开辟了新的可能,其对芳香族腈类底物的高底物特异性催化及定向合成特定羧酸产品提供了新的酶促路,并将加速酶分子改造和定向进化的进程。在此基础上相关技术体系的拓展可能催生出一批高性能、高稳定性的新型生物催化剂及组合,有望改变传统化学工业格局。

文章链接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.4c03851

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